Bioactive Materials: 基于二維銻烯的復合納米藥物通過逆轉細胞熱抵抗增強腫瘤低溫熱療

文章標題：2D antimonene-integrated composite nanomedicine for augmented low-temperature photonic tumor hyperthermia by reversing cell thermoresistance

第一作者：Jianrong Wu and Xiaojun Cai

通訊作者：Bing Hu，Yu Chen, and Yuanyi Zheng

通訊單位：上海交通大學附屬第六人民醫院，上海大學

論文導讀：

光熱治療（PTT）的臨床轉化仍存在一些不可避免的局限性。例如，腫瘤部位誘導的局部高溫和非特異性熱擴散會對周圍健康組織造成損傷。此外，腫瘤深部熱量不足可能導致腫瘤復發和轉移。此外，腫瘤細胞固有的熱抵抗性也是一個關鍵的科學問題。基于此，上海交通大學附屬第六人民醫院鄭元義教授、胡兵教授和上海大學陳雨教授等將通過整合碳酸鈣（CaCO3）和銻烯量子點（AQDs），構建一種“無抑制劑參與”納米系統，用于腫瘤低溫光熱治療。CaCO3納米顆粒被用作納米載體負載AQDs和葡萄糖氧化酶（GOD），同時在表面進行PEG化制備pH響應的納米催化劑（G/A@CaCO3-PEG），借此探索該納米催化劑用于增強低溫PTT的可行性（圖一）。本章采用氣體擴散法合成CaCO3納米顆粒，并將其作為模板，通過一步共沉淀法制備G/A@ CaCO3。制備的G/A@ CaCO3納米催化劑可以在腫瘤微環境的微酸性pH下快速降解，導致負載的GOD和AQDs的釋放。AQDs可以有效地將近紅外激光輻照轉化為局部高熱實現PTT。同時，同時，釋放的GOD催化葡萄糖的氧化。這一葡萄糖消耗過程可以限制ATP的供應，從而導致HSP的下調，因此降低了腫瘤細胞的耐熱性。此外，基于AQDs強的近紅外區吸收，構建的G/A@CaCO3納米催化劑可作為PA成像的造影劑。我們分別在體外細胞水平和體內SW1990荷瘤小鼠模型上系統地研究了這種PA成像引導下的光熱治療效果。

圖一 （a）G/A@ CaCO3-PEG納米催化劑的構建和（b）其治療過程和機制示意圖。該納米催化劑基于CaCO3納米顆粒，共封裝AQDs和GOD，然后進行表面聚乙二醇化。納米催化劑中的GOD可以催化葡萄糖耗竭，減少ATP的供應，進而下調HSP的表達，從而提高了低溫熱療的效率。

研究進展：

采用溫和共沉淀法將AQDs和GOD共包裹在CaCO3中。首先采用液相剝離法合成粒徑均一的AQDs。為了使AQDs具有更好的生理分散性和穩定性，首先使其通過疏水作用和范德華力修飾1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺聚乙二醇（DSPE-PEG）。透射電鏡（TEM）顯示，聚乙二醇化的AQDs具有高分散性，平均直徑為6.7 nm（圖二a）。采用X射線光電子能譜（XPS）分析了AQDs的化學組成。XPS譜圖（圖二b）和特異性XPS譜圖（圖二c）證實了AQDs的O和Sb元素組成。此外，PEG化AQDs顯示了從紫外（UV）到近紅外范圍內的廣泛和濃度依賴性的吸收（圖二d），證實了其PA成像和PTT性能。

接著，將pH敏感的CaCO3納米顆粒作為載體，接著采用共沉淀法將AQDs和GOD共包封。簡言之，將GOD和AQDs添加到含有Ca2+離子的乙醇溶液中，以確保GOD和AQDs被有效封裝。然后加熱使NH4HCO3分解產生的CO2和NH3氣體，并不斷擴散到乙醇溶液中，借此不斷提供碳酸離子和堿性環境，觸發G/A@ CaCO3 納米催化劑的形成。得到的G/A@ CaCO3納米催化劑被1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸（DOPA）、膽固醇和1,2-二十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）組成的脂質雙層包覆，并進一步用DSPE-PEG修飾以提高生理穩定性。透射電鏡觀察到單純的CaCO3呈均勻的球形分布，平均直徑為108 nm（圖二e）。對于G/A@CaCO3-PEG納米顆粒，發現GOD和AQDs的負載對CaCO3結構的直徑和形貌沒有明顯影響（圖二f）。G/A@CaCO3-PEG NPs可以在水、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）和細胞培養基中很好地分散（圖二g）。高角度環形暗場掃描透射電鏡（HAADF-STEM）分析的元素映射（圖二h）清楚地表明了C、O、Ca、Sb和N（存在于GOD中）在整個G/A@CaCO3-PEG納米顆粒中的均勻分布。用Bradford蛋白分析法和電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）分別計算出GOD和Sb的負載量分別為16.8% ± 1.9%和12.7% ± 2.6%（w/w）。由DLS數據可知（圖二i），G/A@CaCO3-PEG和G/A@CaCO3的水動力直徑分別為126 ± 6.3和114 ± 4.8 nm。這些結果證明G/A@CaCO3-PEG納米催化劑的成功構建。

圖二（a）聚乙二醇化AQDs的TEM圖像和（b）XPS譜。（c）AQDs的Sb 3d特異性XPS光譜。（d）不同濃度的PEG修飾的AQDs的紫外吸收光譜。（e） CaCO3的TEM圖像。（f）G/A@CaCO3-PEG的TEM圖（插圖為放大圖像）。（g）G/A@CaCO3-PEG分散在不同介質（水、PBS、DMEM）中14天的照片及水動力粒徑。（h）G/A@CaCO3-PEG元素分布圖。（i）G/A@CaCO3及G/A@CaCO3-PEG的粒徑分布。

已有研究表明，腫瘤的耐熱性主要是由HSPs引起的，HSPs依賴于ATP的能量供應。因此，抑制ATP的產生有望克服腫瘤的耐熱性。因此Western blot檢測不同處理后的SW1990細胞中HSP（HSP70和HSP90）的表達情況。如圖三a所示，近紅外激光照射A@CaCO3-PEG處理后的細胞中HSP70和HSP90表達水平明顯變高，這可能與防御性熱休克反應有關。此外，GOD和G/A@CaCO3-PEG處理均顯著降低了HSP70和HSP90的表達水平，證實了干擾ATP生成可以抑制HSP的過表達。同時對SW1990細胞不同處理后的HSP水平進行定量（圖二b和c），發現A@CaCO3-PEG + NIR處理后，HSP70水平增加了1.44倍，而HSP90水平增加了1.12倍。而在G/A@CaCO3-PEG處理后，相對HSP70和HSP90水平顯著降低至1.93和2.38倍。綜上所述，G/A@CaCO3-PEG可通過下調HSPs的表達來增強基于AQDs PTT的活性。

G/A@CaCO3-PEG納米催化劑引發的策略主要是利用GOD通過減少ATP的產生來抑制HSP的表達，從而增強AQDs的低溫PTT效果。接著我們進一步評價G/A@CaCO3-PEG對SW1990腫瘤細胞的體外PTT作用。結果表明：細胞存活率依賴于G/A@CaCO3-PEG的劑量和激光功率密度（圖二d和e）。在此基礎上，我們利用0.8 W cm-2的近紅外激光觸發低溫PTT。如圖二f所示，A@CaCO3-PEG + 激光和G/A@CaCO3-PEG處理后細胞的相對存活率分別為71.4 ± 3.8%和62.4 ± 3.7%。這是由于單獨使用低溫PTT或GOD誘導的葡萄糖消耗作用相對較小，導致治療效果不理想。此外，G/A@CaCO3-PEG經激光照射后，細胞活力明顯下降至24.8 ± 4.7%。鈣黃綠素-AM/PI雙染色試驗也證實G/A@CaCO3-PEG +激光處理后的表觀細胞死亡高于其他處理（圖二g）。流式細胞定量分析進一步驗證了這些結果（圖二h）。G/A@CaCO3-PEG在沒有激光照射的情況下，由于GOD的饑餓效應導致中度細胞凋亡（61.3%）。而G/A@CaCO3-PEG + 激光治療促進細胞凋亡/壞死最有效（70.7%）。這些結果表明，G/A@CaCO3-PEG聯合激光照射可通過GOD介導的葡萄糖消耗抑制ATP的生成，從而誘導HSP下調，最后通過低溫PTT誘導細胞死亡。

圖 三（a-c）Western blotting分析SW1990細胞中HSPs的表達。（d）不同濃度G/A@CaCO3-PEG聯合激光處理的細胞存活率。（e）細胞經G/A@CaCO3-PEG與不同功率密度激光照射后的存活率。（f）細胞經不同處理后的存活率。（g）不同治療方式處理后的熒光圖片。（h）流式細胞術分析凋亡情況。（Ⅰ）對照組，（Ⅱ） A@CaCO3-PEG，（Ⅲ）A@CaCO3-PEG + laser，（Ⅳ） G/A@CaCO3-PEG，（Ⅴ） G/A@CaCO3-PEG + laser。

最后，為評價體內治療效果，將SW1990荷瘤小鼠隨機分為5組（每組3只）：1）生理鹽水（對照），2）生理鹽水+激光（laser），3）G/A@CaCO3-PEG, 4）A@CaCO3-PEG +激光（低溫PTT），5）G/A@CaCO3-PEG +激光（協同治療）。2、4、5組在注射后12 h，用0.8 W cm-2近紅外激光照射5 min，觸發低溫PTT。在進行不同治療模式后，每2天計算腫瘤體積（圖四a）。結果發現：生理鹽水處理組腫瘤快速生長明顯，而單獨激光照射沒有明顯的抑制作用。與此同時，單獨使用G/A@CaCO3-PEG治療在一定程度上抑制了腫瘤生長（抑制率:38.4%）。而對于A@CaCO3-PEG加激光照射治療的小鼠，抑制率為45.5%。這些現象是由于GOD介導的葡萄糖消耗或單獨低溫PTT僅能產生較低療效。相比之下，第5組（G/A@CaCO3-PEG +激光）處理后的小鼠的腫瘤生長受到有效抑制（抑制率為83.9%），這歸因于GOD介導的饑餓治療與低溫PTT的協同作用。監測腫瘤重量（圖四b）和相應的腫瘤照片（圖四c）顯著地證實了G/A@CaCO3-PEG納米催化劑在激光照射下的治療效果。H&E和脫氧核苷酸轉移酶末端dUTP末端標記（TUNEL）染色結果顯示G/A@CaCO3-PEG + 激光組細胞大面積收縮和核固縮最明顯（圖四d）。

為了闡明協同治療組增強PTT療效的潛在機制，我們通過免疫熒光染色分析檢測腫瘤內HSP70（紅色）和HSP90（綠色）的表達水平（圖四e）。結果顯示：熱療治療（A@CaCO3-PEG + laser）后HSP90表達明顯升高，而G/A@CaCO3-PEG治療后HSP90表達顯著下調，即使在激光照射后也是如此。通過量化各種治療后的腫瘤內ATP水平，我們觀察到G/A@CaCO3-PEG處理的小鼠，基于這一概念驗證評估，很明顯這種增強PTT的作用歸因于GOD誘導的ATP供應限制介導的HSP抑制，可以有效逆轉熱療治療期間的熱抵抗性。

圖四（a）SW1990荷瘤裸鼠經過不同的治療手段后的相對腫瘤生長曲線（每組 5只） 。不同治療模式后腫瘤重量（b）和代表性的離體腫瘤圖片（c）。**P < 0.01， ***P < 0.001。（d）荷瘤裸鼠經過不同的治療手段后腫瘤部位的H&E及TUNEL染色圖。標尺為50 μm。（e）免疫熒光染色法檢測不同處理后小鼠腫瘤中HSP70和HSP90的表達。標尺為50 μm。

總結與展望：

上海交通大學附屬第六人民醫院上海超聲醫學研究所（超聲醫學科）聯合上海大學通過合理整合鈣基生物礦物和單元素2D納米材料，構建了一種高效的pH響應性納米催化劑（G/A@CaCO3-PEG）。納米催化劑通過“無抑制劑參與”策略克服了腫瘤的耐熱性，從而提高了低溫光熱的治療效率。將二維銻烯量子點和葡萄糖氧化酶加入可生物降解的CaCO3納米顆粒中，制備了一種復合納米催化劑。G/A@CaCO3-PEG一旦內化到腫瘤細胞中，會在微酸性的腫瘤微環境中迅速分解。隨后，釋放的GOD有效地耗盡了內源性葡萄糖，阻斷了細胞的能量供應。GOD對ATP供應的限制也可以下調HSP的表達，從而逆轉腫瘤細胞的耐熱性。系統的體外和體內實驗證實這種基于葡萄糖消耗和增強低溫PTT的協同治療模式可以獲得顯著的抗腫瘤性能，且沒有明顯的副作用。這項工作不僅拓展了pH響應的鈣基納米藥物的生物醫學應用，而且還為與熱療相關的納米治療中涉及腫瘤細胞的耐熱性提供了一個有前景的策略。。

論文信息：

Biodegradable cascade nanocatalysts enable tumor-microenvironment remodeling for controllable CO release and targeted/synergistic cancer nanotherapy

Jianrong Wu， Xiaojun Cai，Gareth R.Williams，Zheying Meng，Weijuan Zou，Li Yao，Bing Hu，Yu Chen，Yuanyi Zheng

Bioactive Materials 

DOI：10.1016/j.bioactmat.2021.08.018

原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X21003947